血細(xì)胞是貝類細(xì)胞免疫的承擔(dān)者，直接參與異物的吞噬、包囊、免疫黏附、傷口修復(fù)等過程[1]，同時(shí)能夠合成和釋放多種水解酶、抗菌肽、細(xì)胞因子類似物、調(diào)理素、凝集素等免疫因子，是體液免疫的供給者[2]。
　　關(guān)于貝類血細(xì)胞的研究開始于1934年，興盛在上世紀(jì)70年代中期，主要研究血細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能，了解貝類的防御機(jī)制，以便抵御當(dāng)時(shí)寄生蟲和病菌泛濫引起的大量死亡情況[3]。隨著研究的深入，學(xué)者們所用方法不同導(dǎo)致血細(xì)胞的分類命名存在巨大的差異，目前為止，貝類的血細(xì)胞分類都沒有形成一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本文通過引用國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)目前研究貝類血細(xì)胞分類的幾種技術(shù)方法做出闡述，列舉出一些常見經(jīng)濟(jì)貝類血細(xì)胞的種類名稱，并簡單介紹其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能，為以后貝類非特異性免疫防御相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。
　　1 貝類血細(xì)胞分類研究技術(shù)
　　早期的貝類血細(xì)胞分類研究主要是通過光學(xué)或電子顯微鏡的直接觀察，根據(jù)血細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的形態(tài)、顆粒物質(zhì)的有無以及細(xì)胞外部的形態(tài)結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)方式、血細(xì)胞發(fā)生等來進(jìn)行分類。隨著組織化學(xué)染色方法的成熟和發(fā)展，由于血細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)對(duì)染色劑的親和性不同而呈現(xiàn)顏色上的差異，為血細(xì)胞分類提供了新的研究方法。近些年來，流式細(xì)胞術(shù)、單克隆抗體及密度梯度離心等新型技術(shù)的應(yīng)用為貝類血細(xì)胞的分類提供更多選擇。
　　1.1 顯微鏡觀察技術(shù)
　　顯微鏡觀察技術(shù)分為普通光學(xué)顯微鏡觀察和電子顯微鏡觀察。其中，電子顯微鏡觀察又分為透射電鏡觀察和掃描電鏡觀察。與光學(xué)顯微鏡相比，電子顯微鏡是以電子束作為照明源對(duì)樣品進(jìn)行透射或反射，在通過電磁透鏡的多級(jí)放大后成像于熒光屏上。
　　透射電鏡具有高分辨率、高放大倍數(shù)、成像立體豐富等優(yōu)點(diǎn)，但由于其成像原理也存在樣品制備具有破壞性、電子束直接轟擊樣品表面、需真空環(huán)境及采樣率低等缺點(diǎn)。透射電鏡觀察貝類血細(xì)胞這種細(xì)胞密度低、易凝集、形態(tài)結(jié)構(gòu)多樣的懸浮游離細(xì)胞時(shí)，常規(guī)的樣品制備條件就不太適合。劉靜等[4]從取樣方法、瓊脂包埋方式和鋨酸固定時(shí)間等方面找到了適合菲律賓蛤仔血細(xì)胞透射電鏡的樣品制備方法，指出用固定液潤洗過的注射器收取血淋巴液能有效防止凝集顯現(xiàn)產(chǎn)生，同時(shí)采用離心式的瓊脂包埋方法能最大限度地減少血細(xì)胞的丟失，并且鋨酸固定2 h得到的樣品制備效果最佳。
　　掃描電鏡分辨率高、觀察景深大，可直接觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)，圖像富有立體感、真實(shí)感，除了能顯示一半樣品表面的形貌外，還能將樣品微區(qū)范圍內(nèi)的化學(xué)元素與光、電、磁等性質(zhì)的差異以二維圖像形式顯示出來，并可用照相方式拍攝圖像[5]。
　　總之，透射電鏡常用于觀察普通顯微鏡不能分辨的細(xì)微結(jié)構(gòu)，掃描電鏡則主要用于觀察物體表面的形貌特征。有時(shí)兩者配合可以得到較為全面的分析結(jié)果。
　　1.2 組織化學(xué)染色技術(shù)
　　組織化學(xué)染色技術(shù)是利用一些特殊的染色物質(zhì)可與細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而特異性附著顏色的原理，對(duì)這種成分進(jìn)行定性和定位分析的技術(shù)[3]。此方法可以通過選擇不同的染色劑幾乎可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)各種成分，如：AB-PAS染色法可以顯示糖類；汞溴酚藍(lán)染色法可以顯示蛋白質(zhì)；蘇丹黑B染色法可以顯示脂肪類；Feulgen染色法顯示DNA等等。
　　1.3 流式細(xì)胞技術(shù)
　　流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速定性、定量分析或分選的技術(shù)，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn)，已經(jīng)成為近代科學(xué)研究中的熱門[6]。流式細(xì)胞儀是以流式細(xì)胞術(shù)為核心技術(shù)，將經(jīng)過熒光染色的待測細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，以激光束作為激發(fā)光源垂直照射單行流動(dòng)的細(xì)胞，對(duì)它的散射光和攜帶的熒光進(jìn)行探測，從而完成細(xì)胞分析和分選。
　　1.4 單克隆抗體技術(shù)
　　單克隆抗體技術(shù)是依據(jù)抗原抗體具有特異性結(jié)合的特點(diǎn)，具有特異性的抗體與血細(xì)胞膜上抗原決定部位結(jié)合而反映出血細(xì)胞的不同類別及其免疫功能[7]。
　　1.5 密度梯度離心技術(shù)
　　密度梯度離心一般是純化病毒的一種常用方法[8-9]。原理是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度介質(zhì)的某些特定位置中而形成不同區(qū)帶的分離方法[10]。優(yōu)點(diǎn)是分離出來的細(xì)胞或病毒仍有很好的活性，廣泛用于組織病理學(xué)研究中，近幾年在貝類血細(xì)胞的分類和功能領(lǐng)域得到應(yīng)用。以往主要采用氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖作為梯度介質(zhì)進(jìn)行離心，但由于這幾種介質(zhì)的黏度高時(shí)滲透壓也會(huì)處于較高水平，會(huì)對(duì)部分分離的目標(biāo)病毒或細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此這種介質(zhì)純化出來的病毒或細(xì)胞需要進(jìn)行透析或稀釋才能應(yīng)用于后續(xù)研究。張輝等[10]人使用高親水性、高密度、低黏度的碘克沙醇作為介質(zhì)進(jìn)行梯度離心取得良好效果。
　　2 貝類血細(xì)胞分類
　　不同學(xué)者使用的研究技術(shù)手段以及研究對(duì)象不同，導(dǎo)致對(duì)貝類血細(xì)胞的分類命名存在一定差異（見表1）。
　　顯微鏡觀察法主要是根據(jù)血細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行分類，如陳全震等[11]通過透射電鏡觀察皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，將其分為5種類型，分別為：大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、特殊顆粒細(xì)胞、透明細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。并根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)和細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)特征判斷，大、小顆粒細(xì)胞是同一類細(xì)胞的不同發(fā)育階段，是由特殊顆粒細(xì)胞發(fā)育而來的。透明細(xì)胞和淋巴細(xì)胞則是兩類分化完全的細(xì)胞；Nakayama等[12]使用光鏡和電鏡將紅番硨磲（Tridacna crocea）的血細(xì)胞分為3類，分別為：細(xì)胞內(nèi)含有直徑大約0.6μm顆粒的嗜酸性粒細(xì)胞，包含有低電子密度和少量高電子密度顆粒并擁有光滑表面的無顆粒細(xì)胞，以及細(xì)胞內(nèi)填充大量直徑約3μm高電子密度顆粒的類桑葚型細(xì)胞；Sahaphong 等[13]應(yīng)用光鏡和電鏡觀察耳鮑（Haliotis asinine）血細(xì)胞后認(rèn)為可分為顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞兩類；王江勇等[14]根據(jù)細(xì)胞大小、顆粒組成特征等將雜色鮑（Haliotis diversicolor）血細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞和無顆粒細(xì)胞。

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