摘要
　　以蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌、棉花枯萎病菌、柑橘炭疽病菌與白菜黑斑病菌為供試菌，采用生長速率法測定25種中藥材甲醇粗提物的抑菌活性。結(jié)果表明，在濃度為5.0 mg/mL時，大部分中藥材的甲醇粗提物對至少一種植物病原真菌都表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，其中知母、青蒿、細(xì)辛與白鮮皮對3種供試植物病原菌的抑制率大于75%，而茜草與姜黃對4種供試植物病原菌的抑制率均在80%以上，具有廣泛的抑菌譜。進(jìn)一步采用系統(tǒng)溶劑法得到的茜草不同溶劑萃取物中，水飽和正丁醇相抑菌活性明顯優(yōu)于石油醚及乙酸乙酯相，表明茜草抑菌活性成分主要為中等及大極性化合物。
　　關(guān)鍵詞
　　中藥材；茜草；甲醇提取物；植物病原真菌；抑制活性
　　中圖分類號：
　　S 482.292
　　文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
　　DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.04.020
　　我國藥用植物資源十分豐富，僅中藥典籍《本草綱目》中收錄就超過1 000種，其中相當(dāng)一部分具有抑菌或殺蟲活性。因此，借鑒傳統(tǒng)藥用植物醫(yī)用研究成果，研究其對植物病害的防治作用，已經(jīng)成為國內(nèi)外開發(fā)植物源農(nóng)藥的重要途徑[1]。藥用植物是提取結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的天然產(chǎn)物的重要資源，可從中發(fā)掘具有較好農(nóng)用抑菌活性的先導(dǎo)化合物，進(jìn)而開發(fā)植物源農(nóng)藥[2]。近年來，西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心從苦豆子[3]、大花金挖耳[4]、孜然[5]等藥用植物中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了天名精內(nèi)酯酮和天名精內(nèi)酯醇[6]、枯茗醛和枯茗酸[7]等抑菌活性成分，有望進(jìn)一步開發(fā)為農(nóng)用殺菌劑。本論文選取了25種記載有醫(yī)用抑菌活性的中藥材，對其抑制植物病原真菌活性進(jìn)行了篩選，旨在為發(fā)掘抑菌活性先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。
　　1.2供試植物病原真菌
　　蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）與白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）由山東省農(nóng)業(yè)仿生工程應(yīng)用技術(shù)研究中心提供，并經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院金靜教授鑒定。供試菌株接種在PDA斜面上，4 ℃冰箱保存。使用前，接種至PDA平板表面，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d備用。
　　1.3中藥材甲醇粗提物與茜草不同溶劑萃取物的制備
　　分別稱取各中藥材粉末50 g，用300 mL甲醇浸泡1 h后，超聲波振蕩提取30 min，減壓抽濾，濾渣再采用上述方法處理，重復(fù)3次。合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥得到中藥材甲醇粗提物，密封后置于4 ℃冰箱保存。
　　對初篩具有較好抑菌活性的茜草甲醇粗提物，采用系統(tǒng)溶劑法制備不同極性溶劑的萃取物，進(jìn)一步考察其抑菌活性。將茜草的甲醇粗提物以一定量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，所得萃取液及剩余的水相經(jīng)濃縮干燥，得到茜草不同極性溶劑的萃取物，密封后置于4 ℃冰箱保存。
　　1.4抑菌活性的離體測定
　　采用菌絲生長速率法測定供試中藥材甲醇粗提物及茜草不同溶劑萃取物的抑菌活性。稱取適量甲醇粗提物，以50%乙醇混懸，加入到融化的無菌PDA培養(yǎng)基（約50 ℃）中混勻，得到濃度為5.0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)基中乙醇的含量小于3%，以含等量乙醇的PDA培養(yǎng)基作為對照，每處理3次重復(fù)。
　　稱取適量的茜草不同溶劑萃取物，以50%乙醇混懸，采用上述方法配制成1.0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)基中乙醇的含量小于3%，設(shè)置含等量乙醇的溶劑對照，每處理3次重復(fù)。
　　用打孔器打取生長一致的植物病原真菌菌餅（6 mm），接種于含藥PDA平板以及對照PDA平板的中央（菌餅長滿菌絲一面向下），25 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照平板長滿菌絲時，采用十字交叉法測定菌落直徑，并按以下公式計算抑制率：
　　純生長量（mm）=菌落平均直徑-菌餅直徑；
　　抑制率（%）=
　　對照菌落純生長量-處理菌落純生長量對照菌落純生長量×100。
　　1.5茜草與姜黃甲醇粗提物對植物病原真菌的毒力測定
　　以茜草與姜黃甲醇粗提物抑菌率較高的植物病原真菌為供試菌種，按照1.4所述方法，依次配制得到濃度為2.5、1.0、0.75、0.5與0.25 mg/mL的含藥培養(yǎng)基平板，以加入等量溶劑的平板為對照，每處理3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0對藥劑濃度的對數(shù)（x）與校正抑制率的幾率值（y）進(jìn)行回歸分析，得到毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)及抑制中濃度（EC50）。
　　2結(jié)果與分析
　　2.1中藥材甲醇粗提物的抑菌活性
　　供試中藥材的甲醇粗提物濃度為5.0 mg/mL時，25種中藥材甲醇粗提物中有14種分別對至少1種植物病原真菌的抑制率大于75%，占供試樣品的56%，分布于13個科；而知母、姜黃、青蒿、細(xì)辛、白鮮皮與茜草對至少3種供試植物病原菌的抑制率大于75%，具有廣泛的抑菌譜。其中，茜草甲醇粗提物對蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與柑橘炭疽病菌的抑制率均大于90%，對棉花枯萎病菌也大于85%，值得進(jìn)一步深入研究；而姜黃甲醇粗提物對除蘋果輪紋病菌外的4種供試植物病原菌也表現(xiàn)出較好的抑制活性，抑制率均大于80%（表2）。
　　中藥材甲醇粗提物抑菌活性的選擇性明顯。近40%的中藥材甲醇粗提物分別對蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與柑橘炭疽病菌有較好抑制活性，抑制率均大于75%；其中車前草甲醇粗提物對蘋果腐爛病菌與蘋果輪紋病菌的抑制率均大于95%，但對其余供試植物病原菌沒有抑制活性，具有明顯的選擇性。而對白菜黑斑病菌有較好抑制活性的僅有姜黃與五倍子甲醇粗提物，抑制率分別為80.6%與86.0%。此外，僅有姜黃、茜草與細(xì)辛甲醇粗提物對棉花枯萎病菌的抑制率大于75%，其余均小于60%。

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