摘 要：為了對酶解-連續(xù)流動法測定煙葉中果膠含量的方法進行優(yōu)化，采用Box-Benhnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法對酶解過程中的酶解溫度、酶解時間和緩沖液pH值進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，酶解溫度對果膠測定影響最大，緩沖液pH次之，酶解時間影響最小，且最優(yōu)酶解條件為酶解時間1.9 h、酶解溫度56 ℃、緩沖液pH 3.8；在此條件下，果膠具有良好的線性關(guān)系（R2=0.999），加標(biāo)回收率在99.2%～100.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6）<3%；說明Box-Behnken設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得的果膠測定方法具有較好的精密度及準(zhǔn)確度，適用于煙葉中果膠含量的批量測定。
　　關(guān)鍵詞：響應(yīng)面分析；連續(xù)流動法；煙葉果膠；定量測定
　　中圖分類號：TS411 文章編號：1007-5119（2015）05-0085-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.05.016
　　Abstract： In order to optimize the method of determining tobacco pectin using enzymolysis-flow method， reaction temperature， enzymatic hydrolysis time and buffer pH were studied through the Box-Benhnken experimental design and response surface methodology. The results showed that reaction temperature had the greatest impact on the determination of pectin， followed by buffer pH， and the enzymatic hydrolysis time comes last. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were pH 3.8， time 1.9 h and 56 ℃. Under this condition， the linear relationship of pectin was optimal （R2=0.999）， with the recovery of pectin in tobacco ranged from 99.2% to 100.9%， and the RSD （n=6） was less than 3%. This suggested that the optimized enzymatic hydrolysis conditions used by the Box-behnken design and response surface analysis have good precision and accuracy and are suitable for testing large number of samples.
　　Keywords： response surface methodology； continuous flow method； tobacco pectin； quantitative determination
　　果膠是煙葉細(xì)胞壁中膠層的主要組分，其含量集中在5%～9%[1]，其結(jié)構(gòu)主要是半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸[2]。研究表明，果膠對煙葉保濕能力和柔韌性有著重要的作用[3]；但是，過高的果膠含量在煙草吸食過程中分解產(chǎn)生的甲醇對卷煙安全性具有不利影響[4]。因此，準(zhǔn)確測定煙葉中的果膠含量對于評價煙草品質(zhì)有著重要的意義[5]。
　　目前，果膠測定方法主要有兩大類：一類是直接測定果膠酸含量，果膠含量以果膠酸計，如重量法、容量法為主[2]，該類方法操作復(fù)雜且重復(fù)性差，目前已較少采用；另一類是通過酸解或者酶解將果膠水解，采用現(xiàn)代分析儀器測定水解產(chǎn)物半乳糖醛酸含量，并以半乳糖醛酸來計果膠含量，如咔唑比色法[2]、色譜法[6-12]和酶解-連續(xù)流動法[13-15]等。其中，比色法基質(zhì)干擾較大而造成測定結(jié)果偏高[7-9]，色譜法雖然具有較好的靈敏度及選擇性，但是該方法由于儀器操作復(fù)雜、檢測成本高等特點而難以推廣應(yīng)用。近年來，酶解-連續(xù)流動法是一種備受關(guān)注的測定煙草中果膠含量的新方法，該方法條件溫和、解聚率高且重現(xiàn)性好[16]。然而，果膠酶酶解過程中的酶解溫度、酶解時間及緩沖液pH是影響準(zhǔn)確測定果膠含量的重要因素。為了更為客觀地反映上述三因素對酶解過程的影響及其交互效應(yīng)，文中采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了果膠酶對煙葉中果膠的酶解條件，為采用酶解-連續(xù)流動法準(zhǔn)確測定煙草中果膠含量提供參考。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料和儀器
　　冰乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈣（AR，四川西隴化工有限公司）；對羥基苯甲酸酰肼（純度：98%，ACROS公司）；半乳糖醛酸（純度≥97.0%，F(xiàn)Luka公司）；果膠酶（酶活力：30000 U/g，阿拉�。�；果膠（含量≥74.0%，美國Sigma-Aldrich公司）；檸檬酸和檸檬酸三鈉（AR，上海國藥集團）；0.45 μm水系微孔濾膜（Φ13 mm×0.45 μm，津騰）；濾紙（Φ12.5 cm，杭州特種紙業(yè)有限公司）；煙葉樣品。
　　AA3流動分析儀（德國布朗盧比公司），SHB-III循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司SHZ-D），MS204S電子天平（d=0.1 mg，瑞士梅特勒公司），電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-6北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），水浴恒溫振蕩器（SHA-B金壇市金南儀器廠）和Milli-超純水系統(tǒng)。
　　1.2 實驗方法

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