基于核酸適配體-金納米粒子比色傳感器快速檢測食品中赭曲霉毒素A
發(fā)布時間:2018-06-24 來源: 歷史回眸 點擊:
摘 要:本研究以核酸適配體為識別元件實現(xiàn)對赭曲霉毒素A(OTA)的高選擇性識別,以及采用金納米粒子做為比色探針,建立了適用于OTA快速檢測的比色適配體傳感器。研究結(jié)果表明,該比色傳感器對OTA具有較高的靈敏度和特異性,操作簡單快速,能用于實際食品樣品中OTA的快速篩查檢測;該比色傳感器在520nm和650nm下吸光度的比值(A520/A650)與OTA濃度在0.05~5μM的范圍內(nèi)呈線性相關(guān),檢測限為0.02μM。
關(guān)鍵詞:核酸適配體 金納米粒子 比色傳感器 赭曲霉毒素A
前言
赭曲霉毒素是由多種曲霉和青霉菌產(chǎn)生的一類化合物,包括赭曲霉毒素A、B、C、D,4種結(jié)構(gòu)類似的化合物,其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、對農(nóng)作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉毒素A(OTA)[ 1 ]。OTA以污染糧谷類農(nóng)作物為主,但相繼有報道指出,許多其他種類的食品中也檢測出了OTA,如水果、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料等多種植物產(chǎn)品和食品。由于生物蓄積作用,如許多動物性食品尤其是腎臟、肝臟、肌肉、血液,以及乳和乳制品中常有OTA檢出[ 2 ]。
OTA在食品中的含量通常較低,但較低含量時就可危害人體健康,因此建立一種具有一定靈敏度與專一性,且簡便實用,便于推廣的OTA快速檢測方法具有重要意義。目前應(yīng)用最廣泛的OTA檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)及高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[ 3 ],但這些方法存在著前處理復雜,樣品提取繁瑣、凈化過程及檢測周期長、儀器昂貴、檢測成本高等缺點,而無法用于大量樣本的快速篩查。
核酸適配體是新近發(fā)展起來的一類由指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)篩選產(chǎn)生的單鏈DNA或RNA片段,能特異性地結(jié)合小分子蛋白質(zhì)、多肽、有機物、金屬離子等各種配體,其作為識別分子在醫(yī)療診斷、環(huán)境檢測、基礎(chǔ)分析等多種技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用。金納米粒子具有獨特的光學特性,小粒徑金納米粒子(10~100nm)水溶膠一般呈紅色,當金納米粒子由于外在的作用發(fā)生聚集時,其吸收峰將變寬并發(fā)生紅移,其顏色也由紅色變?yōu)樗{紫色。依據(jù)這一現(xiàn)象,將以核酸適配體為識別元件與以金納米粒子為比色探針相結(jié)合,構(gòu)建的適配體比色探針廣泛地用于各種生化檢測,檢測目標包括生物大分子、癌細胞、金屬離子以及有機小分子[4]。
本研究開發(fā)了一種“雙鏈復合物”模式的比色探針,通過核酸適配體將金納米粒子連接在一起發(fā)生團聚,隨著OTA與核酸適配體的結(jié)合,DNA鏈發(fā)生解鏈,連接在一起的金納米粒子由于靜電作用重新分散于溶液中,溶液顏色相應(yīng)發(fā)生改變,從而實現(xiàn)食品中OTA的快速靈敏檢測。
1 實驗部分
1.1 儀器和試劑
UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司);XS105DU型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q純水機(美國Millipore公司)。
氯金酸(HAuCl4)為分析級,購自于美國Sigma公司;赭曲霉毒素A購自于美國Romer公司;甲醇(HPLC級,德國Merck公司);其余試劑均為分析純,實驗用水是超純水(>18 MQ)。
包含核酸適體的DNA寡聚核苷酸(連接鏈)和兩條與之部分互補的DNA寡聚核苷酸(分別在3’端和5’端進行巰基修飾)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列如下:
連接鏈(粗斜體為OTA適配體部分):5’-ACTCATCTGTGAAGA?GATCGGGTGTGGGTGGCG TAAAGGGAGCATCGGACA -3’;5’端巰基化DNA:5’-HS-CACCCGATCTCT-3’;3’端巰基化DNA:5’-TCACAGATGAGTA10-SH-3’;使用前3種DNA鏈分別用水溶解,配制成100μM的溶液。
1.2 金納米粒子的制備
利用檸檬酸鈉還原法合成實驗用的金納米粒子。具體方法如下:將100mL新鮮配制的1mM的HAuCl4溶液加入到錐形瓶中,于恒溫電磁攪拌器上加熱沸騰2min,然后迅速加入2mL質(zhì)量分數(shù)為5%的檸檬酸鈉溶液,繼續(xù)攪拌,加熱保持沸騰10min,使溶液的顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色,停止加熱,攪拌使其冷卻至室溫,然后將制備的納米金溶液裝入棕色試劑瓶中,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?img src="http://img1.qikan.com.cn/qkimages/spaq/spaq201803/spaq20180327-1-l.jpg" />
1.3 核酸適配體-金納米粒子探針的制備
取5’端巰基化DNA以及3’端巰基化DNA的溶液各100μL加入10mL納米金溶液中,攪拌均勻后,在室溫下放置12h,使DNA鏈通過Au-S鍵結(jié)合到納米金表面,再加入100μL的包含核酸適配體連接鏈溶液,混合均勻后,將溶液加熱至94℃ 2min,快速冷卻至30℃,保持30min,使包含核酸適配體連接鏈與納米金表面結(jié)合的DNA雜交。然后在16000rpm下離心15min,以去除多余的、沒有和納米金結(jié)合的DNA鏈,加水清洗后再次離心,將制備的核酸適配體-金納米粒子探針用10mL濃度為20mM pH=8.5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)分散,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 1.3 核酸適配體-金納米粒子比色探針對OTA的檢測
OTA標準溶液:用甲醇將OTA溶解配制成1mM的標準儲備溶液,臨用前用PBS稀釋成不同濃度的測試液。
實際樣品中OTA的提。簩⒉缓琌TA的玉米樣品徹底粉碎后,加入不同濃度的OTA樣品,充分混勻。稱取5g加標樣品,加入20mL 80%的甲醇水溶液作為提取液,渦旋混勻后震蕩提取30min,離心后將上清液用氮氣吹干,加入200μL甲醇溶解后,加PBS緩沖溶液稀釋至1mL,通過0.45μm的微孔濾膜過濾后作為測試液。
OTA測定:將500μL核酸適配體-金納米粒子探針加入測試管中,再加入500μL待測液,用振蕩器混勻,靜置反應(yīng)15min分鐘,即可用肉眼觀察顏色變化,實現(xiàn)對OTA的快速定性檢測,用紫外可見分光光度計掃描反應(yīng)后的溶液,利用加入OTA后吸光度的變化,實現(xiàn)對OTA的快速定量檢測。
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