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川芎藥材HPLC指紋圖譜研究

發(fā)布時間:2019-08-28 來源: 美文摘抄 點擊:


  摘要:目的 建立川芎藥材的高效液相色譜指紋圖譜。方法 使用色譜柱Thermo C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫,柱溫25 ℃,流速1.0 mL/min,檢測波長323 nm。通過提取11個色譜峰作為指紋圖譜共有峰,分別采用相似度評價,聚類分析和主成分分析等方法,對所收集的18批樣品進行系統(tǒng)比較與歸類。結(jié)果 通過比較18批川芎的色譜圖,確定了11個共有峰,大部分樣品的相似度在0.9以上,并將不同川芎分為3大類。結(jié)論 該方法重復(fù)性好,簡便可靠,可以為川芎的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)。
  關(guān)鍵詞:川芎;指紋圖譜;高效液相色譜法
  中圖分類號:R284.1 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2014)04-0086-04
  川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖,主要栽培于四川、云南、貴州、廣西、湖北等地。川芎始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味辛、微苦、性溫,具有活血祛瘀、行氣開郁、祛風止痛之功,用于血瘀氣滯所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉,肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛,風寒濕痹、跌打腫痛等[1-2]。
  現(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明,川芎的活性成分主要包括揮發(fā)油類、酚酸類和生物堿類[3-4],川芎的質(zhì)量和道地性均與活性成分的含量和種類緊密相關(guān)。中藥質(zhì)量評價一直是中藥研究與應(yīng)用中的難點與重點問題,而建立在中藥成分系統(tǒng)研究基礎(chǔ)上的中藥指紋圖譜分析是一種綜合、有效的評價手段,已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的方法之一[5-8]。為了更深入地研究并揭示川芎的質(zhì)量差異,本試驗對18個批次的川芎藥材采用高效液相色譜法(HPLC)并結(jié)合“中藥材指紋圖譜相似系統(tǒng)”和SPSS統(tǒng)計軟件進行分析,從而評價川芎藥材的質(zhì)量。 1 儀器與試藥
  美國Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng),包括在線脫氣機,自動進樣器Prominence SIL-20A,二極管陣列檢測器Waters2998和柱溫箱CTO-20A;Thermo C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;Anke TGL-16C高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);電子分析天平(FA1204B,上海精密科學(xué)有限公司);恒溫水浴鍋(HH-2K6,鞏義市予華儀器有限責任公司)。
  阿魏酸對照品(批號110773-200611,純度≥98%,中國藥品生物制品檢驗所),甲醇(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司),純凈水(杭州娃哈哈有限公司)。川芎對照藥材(批號120927-200604,中國藥品生物制品檢驗所)。川芎藥材共18個批次,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金老師鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖,密封保存于陰涼干燥處。樣品來源見表1。
  2 方法與結(jié)果
  2.1 色譜條件
  色譜柱:Thermo C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脫:10%A(0 min)~48%A(36 min)~80%A(70 min);流速:1.0 mL/min;檢測波長:323 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL。
  2.2 對照品溶液制備
  精密稱取阿魏酸對照品適量,加甲醇制成每1 mL含阿魏酸328 μg的溶液,即得。
  2.3 供試品溶液制備
  精密稱取川芎粉末2.0 g,置圓底燒瓶中,加入甲醇30 mL,于70 ℃水浴中加熱,冷凝回流提取1 h,放冷,過濾,殘渣同法再提取1次,過濾,合并2次濾液,水浴揮干,用甲醇溶解并定容至10 mL,14 000 r/min離心5 min,吸取上清液,過0.45 ?m濾膜,即得。
  2.4 方法學(xué)考察
  2.4.1 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液,連續(xù)進樣6次,每次10 μL,考察阿魏酸色譜峰保留時間和峰面積的一致性,均RSD<3.0%,說明儀器精密度良好,符合指紋圖譜的要求。
  2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取S9供試品溶液,分別在0、4、8、12、16、24 h進樣10 ?L,依法測定,以阿魏酸保留時間和峰面積計算,結(jié)果均RSD<3.0%。表明川芎樣品在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
  2.4.3 重復(fù)性試驗 取S9樣品,按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件進行測定,以阿魏酸保留時間和峰面積計算,結(jié)果均RSD<3.0%,表明本方法重復(fù)性良好,
  2.5 指紋圖譜測定
  取18批川芎藥材,按照“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣,記錄60 min色譜圖。通過比較18批川芎的色譜圖,確定了11個共有峰,其中4號峰為阿魏酸。結(jié)果見圖1。
  2.6 指紋圖譜的建立與分析
  2.6.1 參比峰的選擇 在各批次樣品圖譜中,4號色譜峰(阿魏酸)分離度較好,峰面積適中,且為各樣品共有,故選擇4號峰為參照峰。
  2.6.2 指紋圖譜的建立及相似度評價 將18批川芎樣品色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004A版),通過多點校正法對色譜峰進行自動匹配,生成川芎提取物的色譜指紋圖譜共有模式(見圖2),并在分析檢驗?zāi)J较拢詷悠稴1圖譜作為參照圖譜,計算相似度(見表2)。結(jié)果顯示,2號樣品的相似度<0.9,其他產(chǎn)地的川芎藥材相似度均≥0.9。
  2.6.3 聚類分析 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件中的系統(tǒng)聚類法中的組間連接法,對川芎HPLC指紋圖譜共有峰的峰面積進行分析,選取平方歐氏距離作為樣品測度。利用此方法對18批川芎進行綜合系統(tǒng)聚類分析,聚類分析圖反映的是各樣品的相似程度,樣品間的分類距離值越大則表明各樣品差異性越大。當分類距離取11時,18類川芎樣品被分為3類:第Ⅰa類為樣品S3、S15、S5、S10、S12、S13、S14、S6、S11、S7,第Ⅱa類為樣品S9、S17、S18、S8、S16、S2、S1,第Ⅲa類為樣品S4。

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