基金項目 2013年海南省科學(xué)事業(yè)費項目“海南苦苣苔科植物2個特有種的引種栽培和快繁技術(shù)研究”（瓊財預(yù)〔2013〕131號）。
　　
　　摘要以煙葉唇柱苣苔葉片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，研究了光照強度和溫度對煙葉唇柱苣苔葉片離體培養(yǎng)的影響，以期篩選出各培養(yǎng)階段最佳光照強度和溫度。結(jié)果表明，葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳光照強度是1 000 lx，最佳溫度為28 ℃，40 d不定芽誘導(dǎo)率95.83%；不定芽增殖和生根的最佳光照強度是1 500 lx，最佳溫度為28 ℃，40 d不定芽增殖倍數(shù)達(dá)7.24倍，生根率100.00%，平均生根數(shù)多達(dá)21.33條。
　　關(guān)鍵詞煙葉唇柱苣苔；溫光條件；葉片；不定芽；組織培養(yǎng)
　　中圖分類號Q949.778.4；Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0155-02
　　
　　煙葉唇柱苣苔（Chirita heterotricha Merr.）是苦苣苔科唇柱苣苔屬多年生草本，生于海拔約430 m的山谷林中或溪邊石上[1]，是海南省特有的野生花卉，具有極大的開發(fā)潛力。湯正輝對煙葉唇柱苣苔葉片不定芽的分化及生根進(jìn)行了研究[2]，但有關(guān)光照及溫度等環(huán)境條件在其離體培養(yǎng)中的影響未見有報道。本試驗以煙葉唇柱苣苔無菌葉片作為試驗材料，研究了不同光照強度和溫度對葉片不定芽的分化、增殖以及生根的影響，以期篩選出各培養(yǎng)階段最為合適的光照強度和溫度。
　　1材料與方法
　　1.1試驗材料
　　植株采自海南省保亭縣，取幼葉作為外植體材料。供試植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）�；�本培養(yǎng)基為MS。
　　1.2試驗設(shè)計
　　以MS為基本培養(yǎng)基，根據(jù)試驗?zāi)康奶砑又参锷�長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA，附加白糖30 g/L、卡拉膠9 g/L，滅菌前pH值為5.8，配制分裝后，于溫度121 ℃、壓力0.14 MPa高溫高壓下滅菌20 min。材料接種后移入培養(yǎng)室，光照強度設(shè)置1 000、1 500、2 000 lx等3個處理，溫度設(shè)置25、28、31 ℃ 3個處理，光照時間8 h/d，每個處理接種8袋，每袋3個材料，3次重復(fù)，定期觀察記錄，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計結(jié)果。
　　1.3試驗方法
　　1.3.1無菌材料的建立。將煙葉唇柱苣苔的幼嫩葉片在自來水中洗去污物，用棉花蘸洗潔精液擦拭葉片兩面，沖洗干凈后移入超凈工作臺，先用75%酒精浸泡10 s，再用0.2‰ HgCl2溶液浸泡3 min，無菌水沖洗3次，最后用2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗5次。將葉片切成1 cm×1 cm見方的小塊，以葉背朝下接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上。接種15 d后，葉面開始膨大隆起，25 d開始有小芽點萌動，40 d在葉片邊緣、主葉脈基部和葉面處均分化出不定芽。取不定芽葉片作為研究試驗材料。
　　1.3.2不定芽的誘導(dǎo)。
　　（1）光照強度對葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。取無菌植株小葉片（約0.5 cm×0.5 cm）以葉背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基[2]，置于溫度28 ℃、不同光照強度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)。
　　（2）溫度對葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。取無菌植株小葉片（約0.5 cm×0.5 cm）以葉背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，置于光照強度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中，40 d后統(tǒng)計葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)。
　　1.3.3不定芽的增殖。
　　（1）光照強度對不定芽增殖的影響。將單個不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，置于溫度28 ℃、不同光照強度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計不定芽增殖倍數(shù)。
　�。�2）溫度對葉片不定芽增殖的影響。將單個不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，置于光照強度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中，40 d后統(tǒng)計不定芽增殖倍數(shù)。
　　1.3.4生根培養(yǎng)。
　�。�1）光照強度對不定芽生根的影響。將高度達(dá)到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，置于溫度28 ℃、不同光照強度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計不定芽生根率、生根數(shù)、株高。
　　（2）溫度對不定芽生根的影響。將高度達(dá)到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，置于光照強度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計不定芽生根率、生根數(shù)、株高和最長根。
　　1.4統(tǒng)計方法
　　計算公式為：不定芽誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出芽葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100，平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/誘導(dǎo)出芽葉片數(shù)，不定芽增殖倍數(shù)=培養(yǎng)40 d不定芽總數(shù)/接種不定芽數(shù)，生根率（%）=生根植株數(shù)/接種植株數(shù)×100，生根數(shù)=植株生根總數(shù)/生根植株數(shù)。試驗結(jié)果均進(jìn)行方差分析，F(xiàn)測驗顯著后用新復(fù)極差法（SSR）進(jìn)行多重比較，統(tǒng)計結(jié)果均為99%水平。
　　2結(jié)果與分析
　　2.1不定芽的誘導(dǎo)
　�。�1）不同光照強度對煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。由表1可知，光照強度1 000 lx時，煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)最高，分別為95.83%和7.10個/葉，芽的生長勢最好；光照強度為1 500 lx時，不定芽誘導(dǎo)率較低，為83.33%，平均不定芽數(shù)為5.50個/葉，芽生長勢較差；光照強度2 000 lx時，不定芽誘導(dǎo)率最低為68.18%，平均不定芽數(shù)也最小為3.36個/葉，芽的生長勢最差，可見光照強度高于1 000 lx時不利于芽的分化和生長，光照強度越高，誘導(dǎo)效果越差。方差分析結(jié)果表明，3種光照強度之間不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)的差異達(dá)到極顯著水平，因此煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)的最適宜光照強度為1 000 lx。
　�。�2）不同溫度對煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。由表2可知，培養(yǎng)溫度28 ℃的不定芽誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到94.74%，平均每葉分化不定芽數(shù)最多，為7.34個，極顯著高于其他處理；25 ℃的不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)次之，與31 ℃的不定芽誘導(dǎo)率差異極顯著，而平均不定芽數(shù)差異極不顯著。從生長勢看，28 ℃的不定芽生長勢最好，25 ℃的次之，31 ℃的最差。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)最佳溫度為28 ℃。
　　
　　
　　
　　
　　
　　2.2不定芽增殖
　�。�1）不同光照強度對煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響。由表3可知，不同光照強度對煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響極大，各處理間的差異達(dá)到極顯著水平，其中1 500 lx的光照強度對不定芽的誘導(dǎo)生長效果最好，40 d不定芽增殖倍數(shù)達(dá)到7.24倍，極顯著高于其他各處理，而且不定芽長勢好，芽苗健壯，葉色深綠。1 000 lx的不定芽增殖倍數(shù)為6.66倍，極顯著高于2 000 lx的增殖倍數(shù)，由此可見，煙葉唇柱苣苔不定芽的增殖不需要太強的光照，1 500 lx的光照強度最適宜不定芽的增殖與生長。
　　
　　
　　
　　
　　（2）不同溫度對煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響。由表4可知，在28 ℃溫度下培養(yǎng)40 d，煙葉唇柱苣苔不定芽的增殖倍數(shù)最高，達(dá)到7.09倍，其次是25 ℃，增殖倍數(shù)為6.28倍，最低的是31 ℃，只有3.93倍。方差分析結(jié)果表明，25 ℃和28 ℃的增殖倍數(shù)差異極不顯著，而二者與31 ℃的差異極為顯著。從生長勢看，25 ℃和28 ℃溫度培養(yǎng)下，不定芽長勢好，芽體健壯，31 ℃培養(yǎng)溫度芽苗長勢差、芽細(xì)、有較多的枯葉。因此，煙葉唇柱苣苔不定芽增殖與生長的適宜的溫度為25~28 ℃，最佳溫度為28 ℃。

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