[摘要] 采用Agilent TC-C₁₈（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以乙腈-水（含0.2%甲酸）為流動相梯度洗脫建立了炙甘草藥材的HPLC指紋圖譜，并采用HPLC-MS/MS對19個共有峰中的6個色譜峰進行了定性鑒別。采用該方法測定了10批不同產(chǎn)地的炙甘草藥材，其相似度在0.72～0.99。該方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，該研究為炙甘草藥材的質(zhì)量控制提供了參考。
　　[關(guān)鍵詞] 炙甘草； HPLC； 指紋圖譜； 質(zhì)量控制
　　[收稿日期] 2014-02-11
　　[基金項目] 國家 “重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項 （2011ZX09201-201-13，2012ZX09301003-001-004，2013ZX09508-105）
　　[通信作者] 喬善義，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥活性成分及質(zhì)量控制，Tel：（010）66930634，E-mail：crbj611202@sina.com
　　[作者簡介] 孫磊，實驗師，Tel：（010）66930634， E-mail：rubyslsl@126.com
　　甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖除去雜質(zhì)、洗凈、潤透并干燥的炮制品，炙甘草是生甘草按照蜜炙法炒至黃色至深黃色的炮制品[1]。甘草素有“十方九草”之謂，具有清熱解毒，補氣益脾胃，潤肺祛痰，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用[2]，而炙甘草雖基原與甘草相同，但經(jīng)炮制后，其性味功效也有區(qū)別，炙甘草具有補脾和胃、益氣復(fù)脈的功效，與生品相比增強了補脾益氣的作用[3]。
　　中藥化學(xué)成分指紋圖譜是指中藥材或中成藥經(jīng)適當?shù)那疤幚砗�，采用一定的分析手段得到的能夠標志該中藥材或中成藥特征的色譜圖或光譜圖�，F(xiàn)行炙甘草藥材的質(zhì)量標準，僅測定甘草苷和甘草酸這2個指標成分的含量，往往不能全面的反應(yīng)炙甘草的質(zhì)量，指紋圖譜技術(shù)從中藥藥效來自多種化學(xué)物質(zhì)綜合作用的觀點出發(fā)，與測定單一組分相比，能夠提供更豐富、有效的質(zhì)量信息，因此指紋圖譜技術(shù)可以更客觀、科學(xué)、合理地進行中藥質(zhì)量控制。本課題組對中藥經(jīng)典方劑小柴胡湯的指紋圖譜進行了系統(tǒng)研究[4-5]，炙甘草是小柴胡湯方劑的重要組成部分，對各單味藥材的HPLC指紋圖譜進行研究是實現(xiàn)對中藥方劑全面質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。對于炙甘草藥材的指紋圖譜研究，已有部分文獻進行了報道[3，6]，但對于炙甘草指紋圖譜中共有峰的定性鑒別，尚未見相關(guān)報道，本文采用HPLC，建立了炙甘草藥材的高效液相色譜指紋圖譜，同時采用HPLC-MS/MS方法對部分色譜峰進行了指認，為炙甘草指紋圖譜中的成分確認及其質(zhì)量控制提供了參考。
　　1 材料
　　日立L-2000高效液相色譜儀；Agilent 6330離子阱質(zhì)譜儀，配有Agilent 1100液相色譜儀；北京長風(fēng)HW·SY-K4型智能電熱恒溫水浴鍋；KQ2200E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；東京理化N-1001D-WA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Sartorius-BS 124S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；安徽科大中佳SC-3614型離心機。
　　水為娃哈哈純凈水；乙腈和甲醇均為色譜純；其余試劑為分析純。10批不同來源炙甘草見表1。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 對照品溶液制備
　　稱取上述G1～G10號炙甘草樣品各10 g，加入10 倍量蒸餾水回流提取2 次，每次2 h，過濾，合并2次濾液。將濾液濃縮至1 mL藥液相當于6 g生藥，加入適量無水乙醇，至溶液中乙醇質(zhì)量分數(shù)為70%，均勻攪拌，靜置過夜，離心（25 min，2 500 r·min^-1），用70%乙醇洗滌沉淀，離心（25 min，2 500 r·min^-1），合并上清，濃縮除去乙醇，將得到的提取物70 ℃真空干燥，得到炙甘草樣品。精密稱取上述樣品0.030 0 g，用50%色譜純甲醇定容至10 mL量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，得到炙甘草供試品溶液，進行HPLC分析。
　　2.2 色譜條件
　　色譜柱為Agilent TC-C₁₈（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；以乙腈（A）-水（B，含0.2%甲酸）為流動相，梯度洗脫，見表2；流速1.0 mL·min^-1；檢測波長265 nm；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。
　　2.3 質(zhì)譜條件
　　離子源為ESI源，負離子掃描模式，霧化氣壓力為2.7×10⁵ Pa，干燥氣流量為10.0 L·min^-1，離子源溫度為350 ℃，碎裂電壓1。梯度洗脫程序同2.2。
　　2.4 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的指認
　　2.4.1 指紋圖譜的建立 取2.1項制備的供試品溶液各20 μL，按照2.2項所述條件下進行測定，得到10批不同來源炙甘草HPLC指紋圖譜，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對保留時間，確定共有峰，并選取其中19個特征色譜峰，建立的HPLC共有模式圖見圖1。
　　2.4.2 共有指紋峰的指認 為進一步闡明炙甘草的化學(xué)組成，采用HPLC-MS/MS技術(shù)并結(jié)合文獻，對HPLC指紋圖譜19個特征色譜峰中的6個色譜峰進行了推測，見表3。
　　2.5 方法學(xué)考察
　　2.5.1 精密度試驗 取2.1項下同一供試品溶液按2.2項下所述條件連續(xù)測定6次，考察各共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD。實驗結(jié)果得到相對保留時間的RSD<0.50%，相對峰面積RSD<10%，表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。
　　2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取2.1項下同一供試品溶液按2.2項下所述條件，分別在0，2，4，6，12，24 h測定其指紋圖譜，考察各共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD。實驗結(jié)果得到相對保留時間的RSD<0.70%，相對峰面積RSD<10%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

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