實(shí)驗(yàn)室菌株管理制度

　1. 目的

　建立實(shí)驗(yàn)室菌株管理制度。

　2. 范圍

　適用于實(shí)驗(yàn)室菌株的管理。

　3. 職責(zé)

　3.1.實(shí)驗(yàn)員和實(shí)驗(yàn)室管理員負(fù)責(zé)對(duì)本制度實(shí)施。

　3.2.QA 負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)本規(guī)程的執(zhí)行。

　4. 規(guī)程

　4.1. 菌種管理

　4.1.1.涉及菌種 ① 大腸埃希菌 Escherichia coli ② 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ③ 銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa ④ 乙型副傷寒沙門菌 Salmonella apecies ⑤ 枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis ⑥ 生孢梭菌 Clostridium sporogenes ⑦ 白色念珠菌 Candida albicans ⑧ 黑曲霉 Aspergillus niger 4.1.2.菌種采購 根據(jù)計(jì)劃及定期檢查的結(jié)果，按時(shí)從省級(jí)藥檢所、衛(wèi)生防疫站等部門采購來自中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（China Medical Culture Collection，CMCC）等國際法定菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株。菌種到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，接受菌種時(shí)應(yīng)仔細(xì)檢查菌種的名稱、數(shù)量、完整性等，并做好記錄工作，如名稱、菌號(hào)、數(shù)量、來源、接種日期、代數(shù)等（見附件一：菌種采購登記表）。

　4.1.3.菌種復(fù)活 4.1.3.1.凍干菌種

　若購入的標(biāo)準(zhǔn)菌株是玻璃安瓿瓶裝的凍干粉劑則需對(duì)凍干菌種進(jìn)行復(fù)活。首先清潔安瓿，安瓿的表面用 75%的酒精擦拭并讓其自然干燥；然后用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟時(shí)必須小心，因?yàn)榘碴秤鰺釙r(shí)可能會(huì)破裂）；再用一無菌吸管移取 1-2ml適宜的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基到安瓿中；輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿使凍干菌種和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解；最后將安瓿內(nèi)菌液轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中在適宜的條件下培養(yǎng)，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌于 30-35℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)，白色念珠菌于 20-25℃培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，黑曲霉于 20-25℃培養(yǎng) 5-7 天。

　4.1.3.2.斜面菌種

　若購入的標(biāo)準(zhǔn)菌株是試管裝瓊脂斜面則不需要進(jìn)行菌種復(fù)活。

　4.1.4.菌種確認(rèn) 取上述凍干菌種（細(xì)菌）的液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物或斜面菌種（細(xì)菌）的斜面培養(yǎng)物劃線接種到胰酪大豆胨瓊脂平皿上，30-35℃培養(yǎng) 48 小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后觀察菌落形態(tài)，然后挑取單一的純菌落，進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，觀察其染色特性及菌形。

　取上述凍干菌種（真菌）的液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物或斜面菌種（真菌）的斜面培養(yǎng)物劃線接種到沙氏葡萄糖瓊脂平皿上，20-25℃培養(yǎng) 5-7 天，觀察菌落形態(tài)，然后挑取單一的純菌落，進(jìn)行染色和鏡檢，觀察其染色特性及菌形。

　4.1.4.1.菌落形態(tài)

　A. 大腸埃希菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，乳白色，光滑，薄，蔓延，半透明。

　B. 金黃色葡萄球菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，白色至淺黃色，光滑，濕潤，全緣。

　C. 銅綠假單胞菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，白色，伸展形，邊緣透明，不規(guī)則，培養(yǎng)基變?yōu)闇\綠色至暗黑色。

　D. 沙門菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，淺灰色，濕潤，光滑，半透明。

　E. 枯草芽孢桿菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，奶油色至微褐色，粗糙，不透明，不閃光，蠟質(zhì)，蔓延。

　F. 生孢梭菌：胰酪大豆胨瓊脂平皿或斜面上，中部突起，白色至淡黃色，邊緣模糊不規(guī)則，表面無光澤。

　G. 白色念珠菌：沙氏葡萄糖瓊脂平皿或斜面上，乳白色，濕潤，光滑，易挑取，正、反面及邊緣、中心顏色一致，質(zhì)地均勻。

　H. 黑曲霉：沙氏葡萄糖瓊脂平皿或斜面上，起初白色，常常出現(xiàn)鮮黃色區(qū)域，后黑色，反面無色或中央部分略帶黃褐色。

　4.1.4.2.鏡檢

　A. 大腸埃希菌：革蘭氏陰性桿菌或短桿菌，無芽孢。

　B. 金黃色葡萄球菌：革蘭氏陽性球菌，排列不規(guī)則，堆聚似葡萄串狀。

　C. 銅綠假單胞菌：革蘭氏陰性桿菌，長短不一，無芽孢。

　D. 沙門菌：革蘭氏陰性桿菌，無芽孢。

　E. 枯草芽孢桿菌：陽性桿菌，部分內(nèi)含芽孢，橢圓形，中生或次端生。

　F. 生孢梭菌：革蘭氏染色陽性，芽孢卵圓形、次端生。

　G. 白色念珠菌：卵圓形，出芽繁殖，革蘭氏陽性。

　H. 黑曲霉：菌絲為有隔的多細(xì)胞，分生孢子梗頂端膨大成頂囊，頂囊的表面以輻射狀長出二層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一串圓形的分生孢子。

　4.1.5.菌種傳代與保藏 4.1.5.1.將微生物接種至一新的培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，菌種的傳代次數(shù)（自原始凍干菌種起）不得超過 5 代。

　4.1.5.2.本實(shí)驗(yàn)室菌種保藏采用斜面低溫保藏法。將菌種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移到 2-8℃冰箱中保藏。視菌種的生長情況，正常情況下芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌）每 3 個(gè)月傳代接種一次，其他細(xì)菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、生孢梭菌）每月傳代接種一次，酵母菌（白色念珠菌）每 4 個(gè)月傳代接種一次，絲狀真菌（黑曲霉）每 4 個(gè)月傳代接種一次。每次傳代接種 2 支或 2 支以上試管，一支作為下一次傳代使用，其他的作為日常檢驗(yàn)中使用。

　4.1.5.3.菌種傳代操作步驟

　細(xì)菌和酵母菌：右手執(zhí)接種工具，左手執(zhí)試管，燒針滅菌，拔塞燒口，挑菌移植，燒口塞管，燒針滅菌，培養(yǎng)。

　霉菌：將 2-3ml 0.9%無菌氯化鈉溶液加入到原菌種管內(nèi)，反復(fù)震搖，將孢子洗脫，取適量孢子懸液接種于瓊脂斜面上，燒口塞管，培養(yǎng)。

　4.1.5.4.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

　大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌使用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 30-35℃培養(yǎng) 24 小時(shí)(枯草芽孢桿菌培養(yǎng) 48 小時(shí))，白色念珠菌和黑曲霉使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20-25℃培養(yǎng) 5-7 天。

　4.1.5.5.質(zhì)量控制

　每次傳代接種以后觀察菌落形態(tài)和染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長，則應(yīng)作進(jìn)一步調(diào)查，所有被確認(rèn)受到污染的菌種應(yīng)及時(shí)銷毀，不得用于實(shí)驗(yàn)中。將符合規(guī)定的菌種進(jìn)行編號(hào)、貼上標(biāo)簽(見附件二、菌株保存標(biāo)簽)，標(biāo)簽中應(yīng)表明名稱、菌號(hào)、編號(hào)、有效期、接種人等。菌種的編號(hào)按接種日期、代數(shù)和數(shù)量編寫。如 2018 年 1 月 1 日傳代接種大腸埃希菌 2 支，用來傳代的大腸埃希菌是第 3 代，那傳代以后的菌種編號(hào)為 20180101-3-1，20180101-3-2，前面的 20180101 是接種日期，中間的 3 表示代數(shù)，最后的 1 和 2 表示數(shù)量。菌種傳代的整個(gè)過程都必須做好詳細(xì)的菌種傳代記錄（見附件三：菌種傳代、確認(rèn)、處理記錄）。

　4.1.6. 菌種儲(chǔ)存

　菌種需單獨(dú)放置于 2-8℃冰箱內(nèi)保藏，有專人負(fù)責(zé)保管并建立實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種清單（見附件四：實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種清單）。

　4.2. 菌種的使用

　4.2.1.菌種必須在有效期內(nèi)才能使用，每次使用應(yīng)做好相應(yīng)的記錄工作（具體見附錄五：菌種使用記錄）

　4.2.2.菌懸液的制備 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌和枯草芽孢桿菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，30-35℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)；白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20-25℃培養(yǎng) 24-48 小時(shí)；黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，20-25℃培養(yǎng) 5-7 天。用 0.9%無菌氯化鈉溶液（稀釋黑曲霉孢子時(shí)加入 0.05%聚山梨醇酯-80）制成實(shí)驗(yàn)中規(guī)定濃度的菌懸液或孢子懸液。稀釋后菌懸液于 2-8℃條件下保存，制備后的 24 小時(shí)內(nèi)使用。

　4.3. 菌種的銷毀

　使用后的菌種，必須經(jīng)過 121℃、30 分鐘高溫高壓濕熱滅菌處理，方可遺棄，同時(shí)做好銷毀記錄。

　4.4. 其他相關(guān)事項(xiàng)

　菌種是特殊的標(biāo)準(zhǔn)品，在一定條件下，許多都是病原菌，如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌等。所以必須實(shí)行嚴(yán)密安全的保藏管理，用于菌種保藏的冰箱需上鎖；有關(guān)菌種的所有操作都應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，僅有微生物實(shí)驗(yàn)員才能使用菌種；操作人員必須穿工作服，配戴手套，口罩等防護(hù)用品；在操作過程中，要求無菌操作，防止交叉污染或?qū)⑽廴緜鞑サ絼e的地方。

　5. 記錄

　菌種采購登記表 菌種保存標(biāo)簽 菌種傳代、確認(rèn)、處理記錄 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種清單 菌種使用記錄 生物指示劑購買和領(lǐng)用記錄 6. 相關(guān)文件

　實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)程

　HYT/SMP-QA-ZB-004 偏差調(diào)查與處理管理規(guī)程

　HYT/SMP-QA-ZB-008 檢驗(yàn)異常管理規(guī)程

　HYT/SMP-QA-ZB-010 7. 參考文獻(xiàn)

　無菌醫(yī)療器具生產(chǎn)管理規(guī)范

　YY0033-2000

　中國藥典 2020 版

　8. 修訂歷史

　序號(hào) 生效日期 文件編號(hào)及版本號(hào) 修訂性質(zhì)及原因 修訂內(nèi)容及具體條款

　附件 1：

　菌種采購清單

　編號(hào)：

　HYT/SMP-QA-ZB-028 日 期 名 稱 菌 號(hào) 代數(shù) 批號(hào) 來 源 數(shù) 量 經(jīng)辦人 復(fù)核人

　附件 2：

　 菌種保存標(biāo)簽

　 HYT/SMP-QA-ZB-028 菌種名稱

　標(biāo) 準(zhǔn) 號(hào)

　菌種編號(hào)

　接種日期

　傳 代 數(shù)

　有 效 期

　傳 代 人

　 附件 3：

　菌種傳代、確認(rèn)、處理記錄 編號(hào)：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌種名稱 菌

　號(hào) 來

　源 代

　數(shù)

　 菌種傳代接種情況：

　菌種

　確認(rèn) 菌落形態(tài)：

　 鏡檢：

　 API 鑒定：

　確認(rèn)結(jié)果

　□符合規(guī)定

　□不符合規(guī)定 操作人：

　復(fù)核人：

　菌種編號(hào)

　保藏條件

　有效期

　處理情況 菌種編號(hào) 滅菌溫度 滅菌時(shí)間 操作人 日期

　 附件 4：

　實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種清單 編號(hào)：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌種名稱

　狀

　態(tài)

　菌

　號(hào)

　大腸埃希菌 Escherichia coli

　 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus

　 銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa

　 沙門菌 Salmonella apecies

　 枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis

　 生孢梭菌 Clostridium sporogenes

　 白色念珠菌 Candida albicans

　 黑曲霉 Aspergillus niger

　“○”表示無，“●”表示有

　 QC/日期：

　部門經(jīng)理/日期：

　 附件 5：

　菌種使用記錄 編號(hào)：

　 HYT/SMP-QA-ZB-028

　菌種名稱及菌號(hào)

　菌種編號(hào)

　有效期

　日

　期 編

　號(hào) 使用人 日

　期 編

　號(hào) 使用人

　 附件 6：

　 生物指示劑購買和領(lǐng)用記錄

　編號(hào)：

　HYT/SMP-QA-ZB-028

　指示劑名稱：

　購買日期：

　批號(hào)：

　數(shù)量：

　保存條件：

　有效期：

　備注：

　日期 數(shù)量 結(jié)余 領(lǐng)用人 發(fā)放人 日期 數(shù)量 結(jié)余 領(lǐng)用人 發(fā)放人

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