不同種源地廣金錢(qián)草藥材質(zhì)量變異與遺傳多樣性分析
發(fā)布時(shí)間:2019-08-28 來(lái)源: 幽默笑話 點(diǎn)擊:
[摘要] 目的:研究不同種源地廣金錢(qián)草藥材質(zhì)量變異及遺傳多樣性,為合理利用廣金錢(qián)草種質(zhì)資源及優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。方法: 采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)18個(gè)種源地廣金錢(qián)草進(jìn)行遺傳多樣性分析,用NTSYSpc2.11F軟件計(jì)算并分析廣金錢(qián)草種質(zhì)間的相似度,構(gòu)建遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);采用HPLC測(cè)定藥材夏佛塔苷含量,并進(jìn)行方差分析。結(jié)果:通過(guò)篩選得到8對(duì)AFLP引物組合,共擴(kuò)增出844個(gè)DNA條帶,多態(tài)性條帶為717個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)平均為84.27%;通過(guò)聚類分析,將18個(gè)種源地的廣金錢(qián)草種質(zhì)分為3大類。種源間廣金錢(qián)草藥材夏佛塔苷含量差異顯著,海南三亞種源夏佛塔苷含量顯著高于其他種源地藥材夏佛塔苷含量。結(jié)論:不同種源廣金錢(qián)草藥材質(zhì)量差異顯著,遺傳多樣性豐富,蘊(yùn)藏著優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源,可以進(jìn)行綜合開(kāi)發(fā)及優(yōu)良品種選育。
[關(guān)鍵詞] 廣金錢(qián)草;質(zhì)量變異;遺傳多樣性
[稿件編號(hào)] 20120917016
[基金項(xiàng)目] 國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目(2007FY110600);中山市科技局華南現(xiàn)代中醫(yī)藥城項(xiàng)目(20101H020)
[通信作者] *楊全,Tel: (020)39352327,Email: yangquan7208@vip.163.com
廣金錢(qián)草為豆科植物廣金錢(qián)草Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分。具有利濕退黃,利尿通淋的功效[1],廣金錢(qián)草主要含有黃酮、生物堿、酚類、揮發(fā)油等化學(xué)成分,現(xiàn)代藥理研究表明本品具有抗泌尿系統(tǒng)結(jié)石、改善心血管系統(tǒng)、抗炎和利膽的作用。也是中成藥“消石飲”、“消炎利膽片”、“消石片”和“金錢(qián)草沖劑”中成藥的主要原料之一[2]。近年來(lái),不少專家學(xué)者對(duì)廣金錢(qián)草的研究主要集中在栽培技術(shù)[3]、藥理[4]、化學(xué)成分[5]等方面,有關(guān)廣金錢(qián)草遺傳多樣性和不同種源地有效成分含量差異方面未見(jiàn)報(bào)道,課題組在進(jìn)行廣金錢(qián)草資源調(diào)查的過(guò)程中,采集了不同種源地PCR樣品和有效成分分析樣品,從有效成分含量差異和遺傳學(xué)的角度探討藥材質(zhì)量變異和遺傳變異。
擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)是一種有效的物種遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記方法[6]。由于其具有快速、靈敏、穩(wěn)定、所需DNA 量少、多態(tài)性豐富和重復(fù)性好等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于人參[7]、黃芩[8]、天麻[9]、夏枯草[10]等植物的遺傳多樣性研究。本文采用AFLP技術(shù),研究不同種源地的廣金錢(qián)草在分子水平上的遺傳變異,采用HPLC分析廣金錢(qián)草質(zhì)量變異情況,為今后開(kāi)展種源選擇、種質(zhì)鑒定、優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 廣金錢(qián)草
廣金錢(qián)草為2008年7—8月分別在廣東、廣西、海南采集的野生樣品,每個(gè)種源取3株廣金錢(qián)草成熟、無(wú)病蟲(chóng)害的健康葉片,混合后作為1個(gè)樣品,將新鮮葉片置裝有變色硅膠的封口袋內(nèi),迅速干燥,備用;每個(gè)種源地采集3份廣金錢(qián)草,干燥后作為有效成分分析樣品備用。種源地及樣品編號(hào)見(jiàn)表1。
1.2 儀器與試劑
高效液相色譜儀(Waters 2695型,USA),二極管陣列檢測(cè)器(Waters 2996型,USA),數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE型,中國(guó)昆山),色譜柱(C18,4.6 mm×250 mm,5 μm, phenomenexLuna),PCR擴(kuò)增儀(9600型,Perkin Elmer, USA),低溫冷凍離心機(jī)(3K18型,Sigma ,USA),測(cè)序儀 (377型,USA ),核酸蛋白檢測(cè)儀(Biorad,USA),電泳儀(DG3D型,北京鼎國(guó))。
內(nèi)切酶、引物、T4 連接酶(北京鼎國(guó)),丙稀酰胺、尿素、甲酰胺、甲叉丙稀雙酰胺(Sigma)。
表1 野生廣金錢(qián)草種質(zhì)資源信息
Table 1 Samples of the wild Desmodium styracifolium germplasm resources
1.3 夏佛塔苷含量測(cè)定
參照《中國(guó)藥典》[1](2010年版一部)廣金錢(qián)草項(xiàng)下的含量測(cè)定方法。流動(dòng)相甲醇水(32∶68);流速0.8 mL·min-1;柱溫 35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng) 272 nm;進(jìn)樣量 10 μL。回歸方程為Y=19 324X-1.315 1,r=1.000 0(n=6);線性范圍0.219~7.841 μg ,r=1.000 0(n=6)。精密度RSD 0.15%(n=6);重復(fù)性RSD 3.7%(n=6);樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定,RSD 0.2%(n=6);加樣回收率RSD 1.7%。以夏佛塔苷作為對(duì)照品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算百分含量。
1.4 AFLP分析
1.4.1 總DNA提取 采用CTAB法[11]進(jìn)行基因組總DNA的提取,用UItrospc 2000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度及濃度。
1.4.2 接頭和引物 從64對(duì)AFLP引物中篩選出8對(duì)帶型分布均勻、多態(tài)性高且分辨力強(qiáng)的引物進(jìn)行AFLP分析,見(jiàn)表2。
1.4.3 酶切與連接 本實(shí)驗(yàn)參照鼎國(guó)生物技術(shù)公司AFLP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先采用NEB (New England BioLabs)公司提供的2種限制性內(nèi)切酶Pst I和Mse I對(duì)基因組總DNA進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶,將Pst I和Mse I接頭與酶切片斷連接起來(lái),酶切連接一步完成,酶切連接體系20 μL:總DNA 4 μL(50 mg·L-1);Adapter 1 μL;Pst I/Mse I 2 μL;10×Reaction buffer 2.5 μL;10 mmol·L-1 ATP 2.5 μL;T4 Ligase 1 μL;ddH2O 7 μL;靹螂x心數(shù)秒,37 ℃保溫5 h,8 ℃保溫4 h,4 ℃過(guò)夜。
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